Es stehen Methoden zum direkten und indirekten Nachweis der STI-Erreger zur Verfügung. Angestrebt werden soll der direkte Nachweis mittels NAT (PCR, Sondendiagnostik) bzw. Mikroskopie (Nativmaterial) und Kultur sowie ggf. die Resistenztestung für N. gonorrhoeae und Candida spp. Während die Bestimmung spezifischer Antikörper bei akuten Erkrankungen eher eine untergeordnete Rolle spielt, ist sie im Verlauf bei einigen STI, wie Lues, HIV-, HCV- und HBV-Infektion, sinnvoll.

Die wichtigsten Differenzialdiagnosen bei sexuell übertragbaren Infektionen (STI oder STD) sind die der Entitäten dieser Erkrankungsgruppe untereinander. Bei Ulzerationen im Genitalbereich ist nach Ausschluss einer STI noch an Balanoposthitis chronica circumscripta plasmacellularis, Erythroplasie, Lichen sclerosus, M. Behcet oder M. Crohn zu denken. Bei Verdacht auf syphilitische Exantheme müssen auch makulopapulöse Arzneimittelexantheme, Psoriasis vulgaris, infektiöse Exantheme, Pityriasis rosea und Scabies erwogen werden. Feigwarzen sollen je nach Lokalisation von Analkarzinom, Marisken im Analbereich, von Pseudokondylomen (Hirsuties papillaris penis), Erythroplasie, bowenoiden Papeln, Scabies granulomatosa oder Verruca seborrhoica im Genitalbereich unterschieden werden. Bei vaginalem Fluor muss an bakterielle Vaginose, hormonell bedingt vermehrten Fluor, vaginale Candida- und Streptokokken-Infektionen und Malignome gedacht werden.

Durch gezielte Diagnostik können Komplikationen der STI detektiert werden (z. B. Liquordiagnostik und bildgebende Verfahren bei Verdacht auf Neurolues). Bei nicht eindeutiger Hepatitis sind auch eine toxische oder Autoimmunhepatitis ggf. auszuschließen. Bei Unterbauchschmerzen sollte eine (ektope) Schwangerschaft durch Bestimmung des humanen Choriogonadotropins (HCG) ausgeschlossen werden.